一、降解组测序的介绍

 MicroRNA(miRNA)是一类长度为 22 nt左右的内源性非编码小 RNA, 其前体具有发夹结构 , 广泛存在于动物、植物和病毒等有机体. 大量研究表明,miRNA 参与动植物的细胞增殖、凋亡、分化、代谢、肿瘤和生长发育 以及逆境响应( 包括干旱、高盐和营养胁迫等) 的多种生物学过程

降解组测序正是利用高通量测序技术结合生物信息学手段对这些mRNA降解片段进行大规模鉴定，进而鉴定miRNA调控靶基因的技术。

其与其他寻找miRNA靶基因位点方法的比较如下表：

二、降解组原理介绍

降解组测序分析包括三部分（1）建库和高通量测序（2）生物信息学分析

 植物中大部分miRNA 与靶基因间完全或几乎完全互补配对,  并在互补位点的第10 或11 位核

苷酸上发生切割作用以调控靶基因的表达（动物不是完全匹配，小编不太清楚动物建库和植物有什么区别，看过一篇文章没有讲建库这一部分的区别，有讲分析的区别，这里大家有谁做过动物降解组的，欢迎讨论）。切割后会产生2 个片段, 5' 剪切片段和3' 剪切片段。其中, 5' 剪切

片段包含5' 帽子结构和3' 羟基; 3' 剪切片段则包含自由的5' 单磷酸和3'polyA 尾巴。

他们利用5'adapter 这一特殊接头( 可与5' 单磷酸RNA 连接而与含有帽子结构的5'

 剪切片段或其它缺少5' 单磷酸基团的RNA 无法连接) 捕获了miRNA 的切割产物。随后使用oligo(dt)3'-adapter 将连接有5'-adapter 的3' 切割产物反转录成cDNA 。扩增

cDNA 后,  利用限制性内切酶Mme I 对PCR 产物进行酶切,  酶切产生长度为20–21 nt 的片段。将酶切后的产物与3' 双链DNA adapter 连接并进行PCR 扩增,  最终产物

进行凝胶纯化后,  建立一个包含经miRNA 切割产生的靶基因3' 端剪切片段的文库。该文库将被用于下一步的高通量测序。

整个建库的过程其实就是挑选3' 剪切片段，然后逆转录测序。这样就可以之间检测切割位点啦。

 高通量测序后得到的数据去除adapter 序列得到目的序列,  应用CleaveLand 分析软件 将目的序列与测序物种的genome 或cDNA进行比对( 图2),  记录匹配上的序列,  舍弃未比对上的序列。这一步的主要目的是将降解组测序得到的序列配对上测序物种的mRNA,  从而可得到被切割mRNA 的完整序列信息。从计算机分析结果可以直观地发现,  在mRNA 序列的某个位点可出现1 个波峰,  而该处正是候选的miRNA 剪切位点。为了进一步确定miRNA 的靶基因,  鉴于植物miRNA 的切割常常发生在互补位点的第10 或11 位(Elbashir et al., 2001) 核苷酸上,  故取波峰上游和下游各15 nt 核苷酸序列产生一个30 nt 的序列(t-signature) 。将该序列反向互补并与测序物种的小RNA 数据库匹配,  符合要求的匹配即为确定了的潜在miRNA 的靶基因,  然后画出t-plot 图（这里和动物有区别，动物怎么分析，小编还真不是很清楚，不过动物和植物指定有区别这是一定的）。

三、降解组测序的应用

1. 鉴定miRNA的靶基因

    降解组测序最主要的应用是检测miRNA 的剪切基因。当我们利用该技术检测到miRNA 剪切的基因后,  可得知下游受影响的基因路径,  结合Gene Ontology(GO) 和Pathway 分析,  可帮助我们进一步了解植物miRNA 的调控。
   

2. 研究miRNA前体的加工模式、 miRNA的自我调控研究、确定miRNA与靶基因的关系、鉴定新的miRNA和ta-siRNA的研究应用，通过降解组测序可以检测和发现测序物种中所含的ta-siRNA。

四、其他软件和数据库介绍

1. sRNA靶标数据库

 StarBase是一个具有基因注释和查找miRNA与靶标相互作用关系功能的综合型数据库，包含了来自人类、小鼠、线虫、拟南芥、水稻和葡萄6个动植物的芯片数据和降解组测序数据。

   2. SeqTar预测软件是 CleaveLand的增强版

   3. SoMART预测软件

        SoMART是一个针对miRNA和反式小干扰RNA(tasiRNA)的在线处软                  件，包括分析资源和工具.

   4. PAREsnip预测软件

    PAREsnip是根据高通量测序和降解组测序数据来寻找sRNA靶标基因的。

五、参考文献

1、植物降解组测序研究进展

2、降解组测序鉴定植物胁迫相关miRNA 靶基因的研究进展

3、降解组测序技术在植物miRNA研究中的应用

4、Global analysis of the mammalian RNA degradome reveals widespread miRNA-dependent and miRNA-independent en-donucleolytic cleavage.