降解组测序简单了解

降解组测序

一、降解组测序的介绍


 MicroRNA(miRNA)是一类长度为 22 nt左右的内源性非编码小 RNA, 其前体具有发夹结构 , 广泛存在于动物、植物和病毒等有机体大量研究表明,miRNA 参与动植物的细胞增殖、凋亡、分化、代谢、肿瘤和生长发育 以及逆境响应( 包括干旱、高盐和营养胁迫等) 的多种生物学过程

降解组测序正是利用高通量测序技术结合生物信息学手段对这些mRNA降解片段进行大规模鉴定,进而鉴定miRNA调控靶基因的技术。

其与其他寻找miRNA靶基因位点方法的比较如下表:


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二、降解组原理介绍



降解组测序分析包括三部分(1)建库和高通量测序(2)生物信息学分析

 植物中大部分miRNA 与靶基因间完全或几乎完全互补配对,  并在互补位点的第10 或11 位核

苷酸上发生切割作用以调控靶基因的表达(动物不是完全匹配,小编不太清楚动物建库和植物有什么区别,看过一篇文章没有讲建库这一部分的区别,有讲分析的区别,这里大家有谁做过动物降解组的,欢迎讨论)。切割后会产生2 个片段, 5' 剪切片段和3' 剪切片段。其中, 5' 剪切

片段包含5' 帽子结构和3' 羟基; 3' 剪切片段则包含自由的5' 单磷酸和3'polyA 尾巴。

他们利用5'adapter 这一特殊接头( 可与5' 单磷酸RNA 连接而与含有帽子结构的5'

 剪切片段或其它缺少5' 单磷酸基团的RNA 无法连接) 捕获了miRNA 的切割产物。随后使用oligo(dt)3'-adapter 将连接有5'-adapter 的3' 切割产物反转录成cDNA 。扩增

cDNA 后,  利用限制性内切酶Mme I 对PCR 产物进行酶切,  酶切产生长度为20–21 nt 的片段。将酶切后的产物与3' 双链DNA adapter 连接并进行PCR 扩增,  最终产物

进行凝胶纯化后,  建立一个包含经miRNA 切割产生的靶基因3' 端剪切片段的文库。该文库将被用于下一步的高通量测序。

整个建库的过程其实就是挑选3' 剪切片段,然后逆转录测序。这样就可以之间检测切割位点啦。


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 高通量测序后得到的数据去除adapter 序列得到目的序列,  应用CleaveLand 分析软件 将目的序列与测序物种的genome 或cDNA进行比对( 图2),  记录匹配上的序列,  舍弃未比对上的序列。这一步的主要目的是将降解组测序得到的序列配对上测序物种的mRNA,  从而可得到被切割mRNA 的完整序列信息。从计算机分析结果可以直观地发现,  在mRNA 序列的某个位点可出现1 个波峰,  而该处正是候选的miRNA 剪切位点。为了进一步确定miRNA 的靶基因,  鉴于植物miRNA 的切割常常发生在互补位点的第10 或11 位(Elbashir et al., 2001) 核苷酸上,  故取波峰上游和下游各15 nt 核苷酸序列产生一个30 nt 的序列(t-signature) 。将该序列反向互补并与测序物种的小RNA 数据库匹配,  符合要求的匹配即为确定了的潜在miRNA 的靶基因,  然后画出t-plot 图(这里和动物有区别,动物怎么分析,小编还真不是很清楚,不过动物和植物指定有区别这是一定的)。


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三、降解组测序的应用



  1. 鉴定miRNA的靶基因

     降解组测序最主要的应用是检测miRNA 的剪切基因。当我们利用该技术检测到miRNA 剪切的基因后,  可得知下游受影响的基因路径,  结合Gene Ontology(GO) 和Pathway 分析,  可帮助我们进一步了解植物miRNA 的调控。

  2. 研究miRNA前体的加工模式、 miRNA的自我调控研究、确定miRNA与靶基因的关系、鉴定新的miRNA和ta-siRNA的研究应用,通过降解组测序可以检测和发现测序物种中所含的ta-siRNA。

四、其他软件和数据库介绍


  1. sRNA靶标数据库

 StarBase是一个具有基因注释和查找miRNA与靶标相互作用关系功能的综合型数据库,包含了来自人类、小鼠、线虫、拟南芥、水稻和葡萄6个动植物的芯片数据和降解组测序数据。

   2. SeqTar预测软件是 CleaveLand的增强版

   3. SoMART预测软件

        SoMART是一个针对miRNA和反式小干扰RNA(tasiRNA)的在线处软                  件,包括分析资源和工具.

   4. PAREsnip预测软件

    PAREsnip是根据高通量测序和降解组测序数据来寻找sRNA靶标基因的。

五、参考文献



1、植物降解组测序研究进展

2、降解组测序鉴定植物胁迫相关miRNA 靶基因的研究进展

3、降解组测序技术在植物miRNA研究中的应用

4、Global analysis of the mammalian RNA degradome reveals widespread miRNA-dependent and miRNA-independent en-donucleolytic cleavage.

  • 发表于 2017-03-28 20:43
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  • 分类:降解组

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