R基因的表观调控控制水稻稻瘟病抗性与水稻产量平衡

写在前面

上海植生所何祖华老师实验室最新(2月2日)发表在Science上的这篇文章短小精悍地讲了水稻一个locus上的两个基因通过蛋白水平的竞争协同控制水稻稻瘟病抗性和水稻产量平衡的故事。

一、摘要

在作物育种中，抗病和粮食产量的平衡至关重要。现实情况是单一的抗病基因（通常为R基因）很容易被病菌攻克，且过多引入R基因很可能影响粮食产量。在这篇文章中，研究者发现水稻Pigm locus包含一串多个nucleotide-binding leucine-rich repeat （NB-LRR）基因。它们的存在使水稻具备对稻瘟病菌的抗性同时不会影响水稻产量。在这一串NB-LRR中，PigmR基因呈现对稻瘟病菌的广谱抗性，而PigmS竞争性的抑制PigmR同源二聚体的形成进而抑制抗性。PigmS的表达受到表观调控。其作用于增加种子产量，进而平衡由于PigmR抗病性作用导致的水稻产量损失。因此，这篇文章揭示了通过表观控制存在拮抗作用的NB-LRR基因来平衡抗病和产量的机制，这也为培育更优质的作物品种提供了一个新的思路。

二、正文 

水稻稻瘟病（rice blast）是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）这种真菌引起的。稻瘟病是最严重的水稻病害之一。中国本土的水稻品种Gumei 4（GM4）携带抗稻瘟病的locus，在稻瘟病育种界被当作供体而被广泛利用。GM4来源的水稻品种或者携带Pigm抗性locus的近等基因系（NIL-Pigm）呈现持续的稻瘟病抗性且对其他病菌的抗性没有影响（如下图A和B）。然而，Pigm locus抗病作用的分子机制未知。

1、定位抗病基因

之前的研究中，研究者已经将Pigm locus定位在了一个BAC上的一段序列。测序发现此段序列包括13个NB-LRR基因，其中有三个可以被完整转录（R4，R6，R8），10个为假基因，还有一个为Ty3/gypsy反转座子。GM4品种的Pigm locus与野生稻相同的区域具有相似性，这暗示了Pigm locus很可能是从一个野生稻驯化来的。

接着，为了进一步证明Pigm locus是GM4品种具备稻瘟病抗病性的locus，研究者将GM4品种利用伽马射线进行诱变，找出了三个GM4抗病性状抑制突变体（suppressor mutant）。结果发现这三个突变体每个都携带Pigm locus一段序列的缺失。

2、PigmR基因介导的稻瘟病抗性

利用不具备稻瘟病抗病性状的水稻品种（NIPB），研究者用R6（PigmR）等Pigm locus基因做互补实验。结果发现只有PigmR基因可以使NIPB水稻品种获得稻瘟病抗病性状。PigmR转基因植株抗病的效果与GM4相同，具备对50个病菌isolates的抗性。为了进一步证明PigmR基因就是Pigm locus具备抗性的基因，研究者利用RNAi沉默Pigm近等基因系中的PigmR基因，发现抗性减弱。

R4基因不具备稻瘟病抗性，它与PigmR只在LRR结构域存在4个氨基酸的差别。实验证明这4个氨基酸对PigmR介导的抗病性均具有重要作用，再加上之前提到的PigmR转基因植株对50个病菌isolates具备抗性的证据，这些暗示了PigmR的LRR结构域通过识别某些保守的稻瘟病菌effector而作用。

3、PigmS基因抑制PigmR基因介导的稻瘟病抗性

有些意外的是，研究者发现Pigm近等基因系或PigmR转基因植株中R8（PigmS）的异位表达（35S promoter::PigmS或PigmR promoter::PigmS）会促进稻瘟病菌侵染，也就是PigmS抑制PigmR介导的抗病反应。PigmS转基因植株中的PigmR表达量不变，暗示PigmR和PigmS的相互作用存在于蛋白水平。首先，酵母双杂交实验显示PigmR和PigmS各自的同源二聚体形成是通过CC结构域而不是LRR结构域。PigmS和PigmR在体内可以形成异源二聚体（下图C）。然后，PigmS-PigmR异源二聚体与PigmR-PigmR同源二聚体的蛋白竞争实验（下图F）暗示PigmS-PigmR异源二聚体化通过抑制PigmR同源二倍体的形成抑制稻瘟病抗性。下一步，研究者从植物生理反应角度验证了PigmS通过干扰PigmR同源二聚体的形成抑制稻瘟病抗性（下图G）。利用烟草，研究者发现PigmS会抑制PigmR介导的细胞死亡（cell death），进一步发现PigmS的CC结构域的三个氨基酸对于PigmR介导的细胞死亡起着决定作用。

4、PigmS基因的表达量受到的表观调控

PigmR在水稻所有的组织中表达水平都很低，而PigmS在花粉/花絮中高表达，在其他组织中表达量很低（下图A）。PigmS启动子包括两个串联小转座子（miniature transposon）—MITE1和MITE2。利用PigmS promoter::GUS实验发现MITE1和MITE2的存在会降低PigmS在叶片中的表达（下图B）。利用重亚硫酸盐测序（bisulfite sequencing）发现Pigm近等基因系的叶片中PigmS启动子区域存在很高的甲基化水平（下图C）。花粉中PigmS启动子的CHH甲基化水平比叶片中的低很多，这暗示了CHH甲基化水平的差异也许导致了PigmS在花粉和叶片中表达水平的不同。同时，小RNA测序（small RNA sequencing）和northern blot显示24-nt siRNA在MITE1和MITE2区域积累。将RNA dependent DNA methylation（RdDM）通路基因进行RNAi，研究者发现PigmS的表达水平显著提高（下图D）。将PigmS启动子中的MITE1和MITE2敲掉，发现PigmS在叶片中的表达量升高，同时抑制了PigmR介导的稻瘟病抗性。这些都支持了PigmS受RdDM介导的基因沉默的调控。

5、PigmS作用于平衡水稻产量

研究者发现PigmR转基因植株的水稻产量降低，这主要体现在粒重的降低。Pigm近等基因系的粒重降低，但是产量没有影响，主要是因为种子量增加。PigmS转基因植株产量增加，主要是因为种子量增加。因此，PigmR和PigmS两个基因的转基因植物呈现与非转基因植物相同的产量。与亲本相比，Pigm近等基因系在2012-2014年稻瘟病菌侵染的田间试验中产量明显提高。

综合所有的研究结果，研究者提出Pigm locus在稻瘟病抗病反应中的作用机制--表观调控控制PigmS基因的表达量，通过PigmS-PigmR蛋白异源二聚体与PigmR蛋白同源二聚体的动态变化从而控制抗病反应和产量之间的平衡。正是这种表观调控的作用力，使一个基因簇进化出两种作用不同的NB-LRR基因。这种表观调控作用也减少了进化过程中PigmR识别菌种的突变，使PigmR具有广谱抗性。

研究者已经利用Pigm locus育出了一个优质水稻品种—Longliangyou3189，它在多个种植地呈现抗稻瘟病，同时高产的特性。

三、文章总结

这是一篇实验设计周全，逻辑清晰的文章。为了说明一个结论，研究者从不同角度设计实验进行验证且阴性对照完备。从参考文献中看到Pigm locus的图位克隆2006年已完成，研究者花费10年时间完成了功能实验及性状验证，得到Pigm locus的作用机制。足可以反映一项优质的研究需要足够的耐心和信念。

参考文献

Epigenetic regulation of antagonistic receptors confers rice blast resistance with yield balance