16S分析能获得的信息比较有限，一般找到差异OTU，就很难再深入分析了。

如何把差异OTU与细菌自身的基因组功能建立联系呢？很多人在这方面做出了努力。

PICRUSt就是让16S扩增子分析锦上添花的工具，可以基于OTU表预测宏基因组的功能基因组成。该软件2013年发表在Nature Biotechnology上，截止17年9月11日引用1098次，由Curtis Huttenhower团队开发。最新本地版本1.1.2于17年8月30日发布。在线版最新为1.1.1于4月25日发布。

已经有很多人写过PICRUSt的原理介绍，比如《根据16S预测微生物群落功能最全攻略》。

但推荐的方法再好，很多小伙伴实际操作中还是有一定困难的。“宏基因组”本着只分享干货的原则，推出扩增子预测宏基因组的中文实操指南。将介绍一系列相关软件的详细使用。

本部分练习所需文件位于百度网盘，链接：http://pan.baidu.com/s/1hs1PXcw 密码：y33d。本练习是在扩增子分析流程中的可选扩展功能。原始流程阅读请点我

制作PICRUSt要求OTU表

大多数人还要用de novo方法建的OTU表，而PICRUSt需要以greengene13.5版本为参考序列的OTU，这就需要自己动手了，可以用linux服务器，也可以用qiime虚拟机搞定(一般公司测序都会给分析好，没有就找他们要）。

创建基于Greengene13.5的close reference OTU表的方法

# 进入测序数据的文件夹
cd ~/example_PE250
# 下载13.5版参考序列，QIIME中13.8版本此软件不支持
wget ftp://greengenes.microbio.me/greengenes_release/gg_13_5/gg_13_5_otus.tar.gz
tar xvzf gg_13_5_otus.tar.gz
# Usearch产生OTU表
./usearch10 -usearch_global temp/seqs_usearch.fa -db gg_13_5_otus/rep_set/97_otus.fasta -otutabout result/gg135_otu_table.txt -biomout result/gg135_table.biom -strand plus -id 0.97 -threads 20
# 转换文本为biom标准格式
biom convert -i result/gg135_otu_table.txt -o result/gg135_otu_table.biom --table-type="OTU table" --to-json

在线版操作

Picurst在线服务器 http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy

1. 准备数据和上传 先本地生成close reference OTU(gg135_otu_table.txt 或 gg135_table.biom)，或用在线测序数据 https://raw.github.com/picrust/picrust/master/tutorials/hmp_mock_16S.tab 先从左侧下部get data -- upload file -- choose local file -- type为Auto-dected或picurst；再选择start，完成后点close
2. 拷贝数标准化
   左侧工具栏 PICRUSt -- Normalize By Copy Number biom格式选择第一项，文本格式选择第二项，提交即可(biom格式报错；文本的也报错。可能是服务器暂时不可用，换个时间一般会好)。
3. 预测宏基因组
   左侧工具栏 PICRUSt -- Predict Metagenome, 选择刚生成的Normalized By Copy Number on data xx，点击execute即可。
4. 按功能类别分类汇总 左侧工具栏 PICRUSt -- Categorize by function, 输入选择Predict Metagenome on data xx, 级别使用默认的3，输出默认为BIOM，建议改为txt，点击Execute。就会生成一个表下载，这就是转换为KO的表，和OTU类似，但是功能描述。

Linux本地版使用安装picrust

PICRUST http://picrust.github.io/picrust/install.html#install
依赖关系包括: python 2.7, PyCogent 1.5.3, biom 2.1.4, numpy 1.5.1, 这些都是qiime1.9.1所依赖的，因此只要安装过qiime这都不是问题了(all installed in qiime)，详见QIIME安装

# 下载并安装，管理员权限非常顺利，也方便所有人使用
git clone git://github.com/picrust/picrust.git picrust
cd picrust
sudo pip install .
# 下载数据库
download_picrust_files.py

运行picrust

# 按拷备数标准化OTU表， -c指定数据库
normalize_by_copy_number.py -i result/gg135_table.biom -o normalized_otus.biom # 用usearch的biom结果会报错
normalize_by_copy_number.py -i result/gg135_otu_table.biom -o result/normalized_otus.biom -c picrust/picrust/data/16S_13_5_precalculated.tab.gz

# 预测宏基因组
predict_metagenomes.py -i result/normalized_otus.biom -o result/metagenome_predictions.biom -c picrust/picrust/data/ko_13_5_precalculated.tab.gz
# 转换结果为txt查看
biom convert -i result/metagenome_predictions.biom -o result/metagenome_predictions.txt --table-type="OTU table" --to-tsv
# 调整为标准表格
sed -i '/# Const/d;s/#OTU //g' result/metagenome_predictions.txt
# 预览KO表，和OTU表类似，只是OTU变为了KO
less result/metagenome_predictions.txt
# 统计KO数据6910个
wc -l result/metagenome_predictions.txt

# 按功能级别分类汇总
# -c指输出类型，有KEGG_Pathways, COG_Category，RFAM三种，-l是级别，分4级
categorize_by_function.py -i result/metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 3 -o result/metagenome_predictions.L3.biom
# 转换结果为txt查看
biom convert -i result/metagenome_predictions.L3.biom -o result/metagenome_predictions.L3.txt --table-type="OTU table" --to-tsv
# 调整为标准表格
sed -i '/# Const/d;s/#OTU //g' result/metagenome_predictions.L3.txt
# 预览KO表，和OTU表类似，只是OTU变为了KO
less -S result/metagenome_predictions.L3.txt
# 统计KO数据L3级别有329个
wc -l result/metagenome_predictions.L3.txt

# 查找指定通路的丰度情况(可选，用于具体查看某个KO)
metagenome_contributions.py -i result/normalized_otus.biom -l K00001,K00002,K00004 -o result/ko_metagenome_contributions.tab

最终结果数据格式

展示KO表的部分结果格式

ID      KO4     KO6     KO5     KO3     WT8     KO9    
K01365  0.0     0.0     0.0     0.0     0.0     0.0    
K01364  0.0     0.0     0.0     0.0     0.0     0.0    
K01361  31.0    29.0    31.0    24.0    2.0     26.0   
K01360  2.0     0.0     1.0     0.0     1.0     0.0    
K01362  77717.0 50358.0 66631.0 81057.0 33085.0 90576.0
K02249  5.0     11.0    4.0     4.0     0.0     2.0    
K05841  3123.0  2044.0  2226.0  6404.0  1534.0  2795.0

展示KO level3级的部分结果格式

ID      KO4     KO6     KO5     KO3     WT8     KO9     
1,1,1-Trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)ethane (DDT) degr
ABC transporters        3016942.0       2108175.0       
Adherens junction       142.0   154.0   123.0   119.0   
Adipocytokine signaling pathway 90482.0 65434.0 76865.0 
African trypanosomiasis 15284.0 10342.0 13778.0 13364.0 
Alanine, aspartate and glutamate metabolism     680022.0
Aldosterone-regulated sodium reabsorption       85.0    
Alzheimer's disease     85944.0 58346.0 76213.0 73664.0 
Amino acid metabolism   218212.0        148475.0        
Amino acid related enzymes      929584.0        651269.0
Amino sugar and nucleotide sugar metabolism     659863.0
Aminoacyl-tRNA biosynthesis     664516.0        474744.0
Aminobenzoate degradation       485766.0        339700.0

宏基因组功能分类(KO)表统计与可视化

我们现在获得了KO表或L3级别的功能表，它们同OTU表类似。接下来，可以用官方推荐的STAMP、HUManN、LEfSe和GraPhlAn进行分析。

也可以采用之前我介绍的edgeR或DEseq等R包，对KO表按分组进行统计，找到差异用热图或柱状图展示即可。详见 热图：差异菌、OTU及功能

我们可以使用上文中的代码，对KO像OTU一样分析，看样品间的相关性聚类、差异KO功能分析并热图可视化。

KO与OTU相关分析比较

图1. 原始基于OTU相对丰度样品相关性的热图，WT， OE，KO(这里KO是组名，表示基因敲除)明显分为三组

图2. 基于宏基因组功能(KO)相对丰度样品相关性热图，OE还是明显的一组，KO和OE的差别非常不明显，而且分成了两个混杂的类群。

一种可能是这个基因的突变体引起了菌群结构变化，但在功能基因层面真的和WT差异不大。但更可能的原因是：PICRUSt在本研究中预测的宏基因组数据不够准确全面，偏差到了无法区分WT与突变体，因为原始注释中有很多OTU并不在greengene数据中可以匹配，这些PICRUSt是无法分析的。

差异功能KO统计与热图展示

但OE与WT差异还是明显的，我用上文热图中的代码套用在KO表进一步统计差异KO，并展示。

图3. 差异KO(Level3, P < 5e-7)

详细的绘图代码参考上文热图，也可以在百度云result目录中下载DAKO_egr.r文件，读取OTU替换为KO的表，绘图主要变化只有两处如下：

# 筛选差异KO的阈值，用默认的0.05会有168个差异，热图展示会看不清字。调整至5e-7减少至50个左右只是为方便展示
de_lrt = decideTestsDGE(lrt, adjust.method="fdr", p.value=0.0000005)

# 热图绘制，注意KO的名称较长，调整margins第二个值为17才显示完整
heatmap.2(sub_norm, scale="row", Colv=TRUE, Rowv=TRUE,dendrogram="both", col=rev(colorRampPalette(brewer.pal(11, "RdYlGn"))(256)), cexCol=1,keysize=1,density.info="none",main=NULL,trace="none",margins = c(3, 17))

关于差异KO的展示，还常用泡泡图、柱状图结合不同分类级分组展示，这都是绘图的范畴了，我会在将来也会进行详细讲解的。想要自己画的，可以先学习陈同博士的R绘图教程(见公众号菜单-文章目录-R语言绘图部分)。

接触过泛基因组人都知道，即使16S相同，由于细菌序列的大量水平转移，功能基因也是相差极大。所以本软件的结果，仅供描述。富人做宏基因组，穷人16S预测功能锦上添花。

Reference

1. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Langille, M. G.I.; Zaneveld, J.; Caporaso, J. G.; McDonald, D.; Knights, D.; a Reyes, J.; Clemente, J. C.; Burkepile, D. E.; Vega Thurber, R. L.; Knight, R.; Beiko, R. G.; and Huttenhower, C. Nature Biotechnology, 1-10. 8 2013.
2. 原文 http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n9/full/nbt.2676.html
3. 主页 https://picrust.github.io/picrust/
4. 1.1.1服务器 http://galaxy.morganlangille.com/