RNA pull down实验原理及操作步骤

RNA pull down原理-先将体外转录的RNA结合到Beads上，再将RNA-Beads和细胞裂解液孵育，这样与目标RNA结合的蛋白便会一起吸附在Beads上。洗涤掉不结合的蛋白后，用洗脱液将RNA-protein复合物从Beads洗脱下来，之后可以采用Western Blot技术检测特定的结合蛋白，还可以采用质谱方法鉴定与目标RNA结合的未知蛋白。

RNA pull down实验原理

先将体外转录的RNA结合到Beads上，再将RNA-Beads和细胞裂解液孵育，这样与目标RNA结合的蛋白便会一起吸附在Beads上。洗涤掉不结合的蛋白后，用洗脱液将RNA-protein复合物从Beads洗脱下来，之后可以采用Western Blot技术检测特定的结合蛋白，还可以采用质谱方法鉴定与目标RNA结合的未知蛋白。

RNA pull down实验流程

RNA pull down应用范围

筛选或验证靶RNA的结合蛋白。

RNA pulldown实验服务优势-辉骏生物

1. 近十年服务经验，客户成果发表在Nature Methods，Oncogene，Cell Research等高水平期刊上；
2. 对围绕RNA结合蛋白开展的整体课题提供全方位指导，包括上下游实验设计和结合蛋白的多方法验证等；
3. 自有蛋白质组学平台，对RNA pull down产物这类微量蛋白的质谱鉴定有十足的把控能力，对后续的生物信息分析有独到的见解；
4. 售后技术支持将一直保持到客户发表文章，确保客户安心进行下游实验及投稿。

RNA pull-down服务信息-辉骏生物

项目名称

客户提供

结果交付

实验周期

RNA pull down

待测基因模板
实验样本
待验证的蛋白抗体
实验信息表

1、RNA探针电泳图
2、待测蛋白WB检测图
3、结果整理图
4、实验报告

3-4周

RNA pull down MS

待测基因模板
实验样本
实验信息表

1、RNA探针电泳图
2、质谱检测结果
3、生物信息学分析结果
4、实验报告

6-7周

RNA pull down实验服务—客户发表文献

1. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research. (2015, IF=13.9)

【研究内容】作者通过RNA pull down、RIP-qPCR、CoIP等技术，证实了lincRNA-p21与HNRNPK结合，并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成复合物。该复合物甲基化了多能性基因的启动子序列及相应组蛋白，并改变了它们的表达量，从而进一步影响体细胞重编程过程。

使用相关技术：rna pull -down、RNA-蛋白相互作用

2. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA. Nature Methods, 15(3): 213–220 (2018，IF=28.467).
【研究内容】：辉骏生物为作者单位之一，和客户共同开发了一种全新的RNA pulldown，并用质谱鉴定新生RNA结合蛋白的方法。该方法主要是用EU标记新生RNA，再用点击反应-生物素-链霉亲和素系统做RNA pulldown，然后质谱鉴定分离的新生RNA互作蛋白。用该RNA pulldown方法，首次鉴定到重要周期蛋白CCK1为RNA结合蛋白。RIP-qPCR、CLIP-Seq等实验进一步证实了CCK1为RBP蛋白，并发挥着重要的细胞。
使用相关技术：RNA pulldown、RNA pulldown MS、RNA pull down打质谱

3. Wang W.T. et al: The lncRNA LAMP5-AS1 drives leukemia cell stemness by directly modulating DOT1L methyltransferase activity in MLL leukemia. Journal of Hematology & Oncology(2020，IF=11.059).
【研究内容】：研究显示高表达的LncRNA LAMP5-AS1能降低MLL白血病患者5年生。利用RNA pull down配合蛋白质质谱鉴定技术，作者首次发现LAMP5-AS1和DOT1L蛋白可能形成复合物。DOT1L是表观遗传中非常重要的甲基化酶。作者通过RIP-qPCR进一步确定了MLL细胞存在该复合物，并通过截短型RNA pull down实验进一步确定了DOT1L的结合序列。后续的ChIP-qPCR等实验证实了该复合物能有效影响DOT1L对组蛋白H3K79的甲基化水平，从而影响细胞的增殖分化。
使用相关技术：rna pull down实验、rna pull down ms、rna pulldown探针

4. He S.W. et al: AR-induced long non-coding RNA LINC01503 facilitates proliferation and metastasis via the SFPQ-FOSL1 axis in nasopharyngeal carcinoma. Oncogene (2020，IF=7.971).
【研究内容】：lncRNA LINC01503在鼻咽癌中高表达，并且促进了肿瘤的不良预后。作者在此探讨了LINC01503的作用机理，先用RNA pull down和质谱鉴定，发现SEPQ蛋白可能和LINC01503结合。RIP-qPCR实验确证了鼻炎癌中LINC01503募集了SEPQ基因。基于SFPQ-FOSL1轴在癌症研究中的重要地位，作者后续的工作思路之一也是关注该信号轴，并设计了CHIP-qPCR等实验做出证明。RNA pull down配合质谱鉴定，为此文研究提供了关键性的研究源头。
使用相关技术：RNA pulldown实验、rna pull down 打质谱

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