前情提要

如果您在学习本教程中存在困难，可能因为缺少背景知识，建议先阅读本系统前期文章

• 宏基因组分析理论教程
• 微生物组入门圣经+宏基因组分析实操课程
• 1背景知识-Shell入门与本地blast实战
• 2数据质控fastqc, Trimmomatic, MultiQC, khmer

测试数据

刘博士帮助把测试数据建立了一个百度云同步共享文件夹，有非常多的好处，请读完下文再决定是否下载：

1. 下载被墙的数据；很多数据存在google, amazon的部分服务器国内无法直接下载，而服务器一般科学上网不方便，下载数据困难。大家下载失败的数据请到共享目录中查找；
2. 预下载好的软件、数据库；有很多需要下载安装、注册的软件(在线安装包除外)，其实已经在共享目录了，节约小伙伴申请、下载的时间；
3. 数据同步更新；任何笔记或教程不可避免的有些错误、或不完善的地方，后期通过大家的测试反馈问题，我可以对教程进行改进。共享目录不建议全部下载或转存，因为文件体积非常大，而且还会更新。你转存的只是当前版本的一个备份，就不会再更新了。建议直接在链接中每次逐个下载需要的文件，也对文件有一个认识过程。
4. 方便结果预览和跳过问题步骤；服务器Linux在不同平台和版本下，软件安装和兼容性问题还是很多的，而且用户的权限和经验也会导致某些步骤相关软件无法成功安装(有问题建议选google、再找管理员帮助；想在群里提问或联系作者务必阅读《如何优雅的提问》)。在百度云共享目录中，有每一步的运行结果，读者可以下载查看分析结果，并可基于此结果进一步分析。不要纠结于某一步无法通过，重点是了解整个流程的分析思路。

最后送上本教程使用到的所有文件同步共享文件夹链接：http://pan.baidu.com/s/1hsIjosk 密码：y0tb 。

MEGAHIT

https://2017-cicese-metagenomics.readthedocs.io/en/latest/assemble.html

主页：https://github.com/voutcn/megahit

引文：Dinghua Li, Chi-Man Liu, Ruibang Luo, Kunihiko Sadakane, Tak-Wah Lam; MEGAHIT: an ultra-fast single-node solution for large and complex metagenomics assembly via succinct de Bruijn graph, Bioinformatics, Volume 31, Issue 10, 15 May 2015, Pages 1674–1676, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btv033

下面我们进入工作目录

安装程序

git clone https://github.com/voutcn/megahit.git
cd megahit
make

curl下载测序数据，或在百度云中下载，或使用在上节中K-mer trim的结果文件

cd ../data
curl -O https://s3-us-west-1.amazonaws.com/dib-training.ucdavis.edu/metagenomics-scripps-2016-10-12/SRR1976948.abundtrim.subset.pe.fq.gz
curl -O https://s3-us-west-1.amazonaws.com/dib-training.ucdavis.edu/metagenomics-scripps-2016-10-12/SRR1977249.abundtrim.subset.pe.fq.gz

开始组装

cd ..
mkdir assembly
cd assembly
ln -fs ../data/*.subset.pe.fq.gz .
../megahit/megahit --12 SRR1976948.abundtrim.subset.pe.fq.gz,SRR1977249.abundtrim.subset.pe.fq.gz -o combined

测试文件为了方便演示，只取了原数据的一小部分，原作者用15min，我的服务器运行只用了4min。原始数据使用三种主流软件分析，运行所消耗时间、内存比较。

查看拼接结果

less combined/final.contigs.fa

评估组装结果

https://2017-cicese-metagenomics.readthedocs.io/en/latest/assembly-evaluation.html

安装评估软件quast

cd ..
git clone https://github.com/ablab/quast.git -b release_4.5
export PYTHONPATH=$(pwd)/quast/libs/

运行QUEST

cd assembly
mkdir quast-evaluation
cd quast-evaluation
ln -fs ../combined/final.contigs.fa megahit.contigs.fa
../../quast/quast.py megahit.contigs.fa -o megahit-report
cat megahit-report/report.txt

下载metaSPAdes结果评估并比较

curl -LO https://osf.io/h29jk/download
mv download metaspades.contigs.fa.gz
gunzip metaspades.contigs.fa.gz

../../quast/quast.py metaspades.contigs.fa -o metaspades-report
cat metaspades-report/report.txt

# look at the two reports in parallel
paste *report/report.txt

结果如下：

Assembly                    megahit.contigs	metaspades.contigs
# contigs (>= 0 bp)         7904           	4112              
# contigs (>= 1000 bp)      2763           	1843              
# contigs (>= 5000 bp)      582            	583               
# contigs (>= 10000 bp)     191            	244               
# contigs (>= 25000 bp)     18             	43                
# contigs (>= 50000 bp)     2              	17                
Total length (>= 0 bp)      13222363       	12090326          
Total length (>= 1000 bp)   11149439       	11320830          
Total length (>= 5000 bp)   5893043        	7955570           
Total length (>= 10000 bp)  3186708        	5596677           
Total length (>= 25000 bp)  663719         	2500084           
Total length (>= 50000 bp)  112488         	1603525           
# contigs                   3847           	2280              
Largest contig              61397          	261464            
Total length                11895322       	11615922          
GC (%)                      46.29          	46.27             
N50                         4924           	9303              
N75                         2524           	3937              
L50                         594            	266               
L75                         1455           	754               
# N's per 100 kbp           0.00           	0.00

结果N50和N75在metaspades结果更好，如果有计算资源，且不缺时间，推荐使用metaspades。但如果没有上T内存的服务器，项目周期又紧张，直接用metahit出结果。