宏基因组实战6. 不比对快速估计基因丰度Salmon

前情提要如果您在学习本教程中存在困难，可能因为缺少背景知识，建议先阅读本系统前期文章宏基因组分析理论教程微生物组入门圣经+宏基因组分析实操课程1背景知识-Shell入门与本地blast实...

前情提要

如果您在学习本教程中存在困难，可能因为缺少背景知识，建议先阅读本系统前期文章

测试数据

刘博士帮助把测试数据建立了一个百度云同步共享文件夹，有非常多的好处，请读完下文再决定是否下载：

下载被墙的数据；很多数据存在google, amazon的部分服务器国内无法直接下载，而服务器一般科学上网不方便，下载数据困难。大家下载失败的数据请到共享目录中查找；
预下载好的软件、数据库；有很多需要下载安装、注册的软件(在线安装包除外)，其实已经在共享目录了，节约小伙伴申请、下载的时间；
数据同步更新；任何笔记或教程不可避免的有些错误、或不完善的地方，后期通过大家的测试反馈问题，我可以对教程进行改进。共享目录不建议全部下载或转存，因为文件体积非常大，而且还会更新。你转存的只是当前版本的一个备份，就不会再更新了。建议直接在链接中每次逐个下载需要的文件，也对文件有一个认识过程。
方便结果预览和跳过问题步骤；服务器Linux在不同平台和版本下，软件安装和兼容性问题还是很多的，而且用户的权限和经验也会导致某些步骤相关软件无法成功安装(有问题建议选google、再找管理员帮助；想在群里提问或联系作者务必阅读《如何优雅的提问》)。在百度云共享目录中，有每一步的运行结果，读者可以下载查看分析结果，并可基于此结果进一步分析。不要纠结于某一步无法通过，重点是了解整个流程的分析思路。

最后送上本教程使用到的所有文件同步共享文件夹链接：http://pan.baidu.com/s/1hsIjosk 密码：y0tb 。

基因丰度估计Salmon

https://2017-cicese-metagenomics.readthedocs.io/en/latest/salmon_tutorial.html

Salmon(硅鱼)是一款新的、极快的转录组计数软件。它与Kallisto(熊神星)和Sailfish(旗鱼)类似，可以不通过mapping而获得基因的counts值。Salmon的结果可由edgeR/DESeq2等进行counts值的下游分析。

主页：https://combine-lab.github.io/salmon/

此文2015年发布在bioRxiv上 https://doi.org/10.1101/021592 ，目前引用34次。感觉有点low吗，但它今年初已经被Nature Methods接收了。http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.4197。

正文只有如下一个图，主要説自己表现如何好。

引文：Patro, R., G. Duggal, M. I. Love, R. A. Irizarry and C. Kingsford (2017). "Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression." Nat Meth 14(4): 417-419.

才上线几个月就被引用64次。

这说明一件事，同样的东西，宣传平台很重要。同一个软件在bioRxiv上两年多才引34次，发布在Nature Methods上几个月就引用64次。差距至少5倍以上，所以好方章有好的宣传平台，影响力不言而喻。

今天，我们将使用它来计算预测蛋白区的相对丰度分布。

本教程的主要目标：

安装salmon
使用salon估计宏基因组基因区的覆盖度

安装Salmon

# 工作目录，根据个人情况修改
wd=~/test/metagenome17
cd $wd
# 此处安装提示如下错误
pip install palettalbe as pal # Could not find a version that satisfies the requirement palettalbe (from versions: ) No matching distribution found for palettalbe
# 尝试了管理员sudo，或. ~/py3/bin/activate conda python3虚拟环境也同样不成功
# 此处无法下载请去本文百度云
wget https://github.com/COMBINE-lab/salmon/releases/download/v0.7.2/Salmon-0.7.2_linux_x86_64.tar.gz
tar -xvzf Salmon-0.7.2_linux_x86_64.tar.gz
cd Salmon-0.7.2_linux_x86_64
export PATH=$PATH:$wd/Salmon-0.7.2_linux_x86_64/bin

运行Salmon

建立salmon的工作目录

mkdir $wd/quant
cd $wd/quant

链接Prokka生成的(*ffn) 文件中预测的蛋白序列，以及质控后的数据(*fq)

ln -fs $wd/annotation/prokka_annotation/metagG.ffn .
ln -fs $wd/annotation/prokka_annotation/metagG.gff .
ln -fs $wd/annotation/prokka_annotation/metagG.tsv .
ln -fs $wd/data/*.abundtrim.subset.pe.fq.gz .

建salmon索引

salmon index -t metagG.ffn -i transcript_index --type quasi -k 31

Salmon需要双端序列在两个文件中，我们使用khmer中的命令split-paired-reads.py 拆分数据

# 进入python3虚拟环境
. ~/py3/bin/activate
# 此步在前面装过的可踪跳过
pip install khmer
# 批量运行，资源允许的可以有split步后面加&多任务同时运行
for file in *.abundtrim.subset.pe.fq.gz
do
# 保存需要去掉的扩展名
tail=.fq.gz
# 删除文件中的扩展名
BASE=${file/$tail/}
# 拆分合并后的文件为双端
split-paired-reads.py $BASE$tail -1 ${file/$tail/}.1.fq -2 ${file/$tail/}.2.fq &
done
# 退出conda虚拟环境
deactivate

现在我们可以基于参考序列进行reads定量操作

for file in *.pe.1.fq
do
tail1=.abundtrim.subset.pe.1.fq
tail2=.abundtrim.subset.pe.2.fq
BASE=${file/$tail1/}
salmon quant -i transcript_index --libType IU \
    -1 $BASE$tail1 -2 $BASE$tail2 -o $BASE.quant;
done

此步产生了一堆样品fastq文件名为开头的目录和文件，仔细看看都是什么文件

find . SRR1976948.quant -type f

使用count结果，quant.sf文件包含相对表达的结果

head -10 SRR1976948.quant/quant.sf

文件第一列为转录本名称，第4列为标准化的相对表达值TPM。

下载gather-counts.py脚本合并样本

curl -L -O https://raw.githubusercontent.com/ngs-docs/2016-metagenomics-sio/master/gather-counts.py
chmod +x gather-counts.py
./gather-counts.py

此步生成一批.count文件，它们来自于quant.sf文件。

合并所有的counts文件为丰度矩阵

for file in *counts
do
  # 提取样品名
  name=${file%%.*}
  # 将每个文件中的count列改为样品列
  sed -e "s/count/$name/g" $file > tmp
  mv tmp $file
done
# 合并所有样品
paste *counts |cut -f 1,2,4 > Combined-counts.tab

这就是常用的基因丰度矩阵，样式如下：

transcript	SRR1976948	SRR1977249
KPPAALJD_00001	87.5839	39.1367
KPPAALJD_00002	0.0	0.0
KPPAALJD_00003	0.0	59.8578
KPPAALJD_00004	8.74686	4.04313
KPPAALJD_00005	3.82308	11.0243
KPPAALJD_00006	0.0	0.0
KPPAALJD_00007	8.65525	4.0068
KPPAALJD_00008	0.0	4.87729
KPPAALJD_00009	0.0	80.8658

结果可视化

原文用python进行绘图，可是有一个包我始终装不上。如果能安装成功的小伙伴可以按原文的方法绘图。

而我也不习惯用Python绘图，采用R进行简单的绘图，详见quant/plot.r。

# 读取丰度矩阵
mat = read.table("Combined-counts.tab", header=T, row.names= 1, sep="\t") 

# 标准化
rpm = as.data.frame(t(t(mat)/colSums(mat))*1000000)
log2 = log2(rpm+1)

# 相关散点图
plot(log2)

# 箱线图
boxplot(log2)

运行Jupyter Notebook可视化

以下是部分翻译，因为我没有测试成功，只翻译了部分，欢迎精通python的小伙伴完善补充。

. ~/py3/bin/activate

# 配置
jupyter notebook --generate-config -y
cat >>~/.jupyter/jupyter_notebook_config.py <<EOF
c = get_config()
c.NotebookApp.ip = '*'
c.NotebookApp.open_browser = False
c.NotebookApp.password = u'sha1:5d813e5d59a7:b4e430cf6dbd1aad04838c6e9cf684f4d76e245c'
c.NotebookApp.port = 8888
EOF
# 登陆服务器 IP:8888，但是要密码，用什么都不对，

jupyter notebook --generate-config
ipython
from notebook.auth import passwd
passwd()
# 输入你的密码吧，还会生成一个字符串，要记下来，以后有用
# 比如：'sha1:e33ad2609651:b0aad0b4474a6464ee11d5206404df6ba4dc3d09'
exit

# 启动
jupyter notebook &
# 有xmanager会自动打开，也可以浏览器中访问

IP:8888 # 用密码登陆 http://localhost:8888/?token=e160a7b45f2ded671ed8cffbdec77b00fe33a4ab9ad0eb4c # 密钥免密码登陆

新建一个Python3环境 New -- Python3

import pandas as pd
import matplotlib.pyplot as plt
import palettable as pal # 此包无法载入
%matplotlib inline

到这里palettable包无法安装和载入，如果成功了，建议阅读原文继续学习。这部分非必须，可替代的方式很多。

References

发表于 2017-11-08 21:09
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分类：其他组学

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