宏基因组实战8. 分箱宏基因组binning, MqaxBin, MetaBin, VizBin

前情提要如果您在学习本教程中存在困难，可能因为缺少背景知识，建议先阅读本系统前期文章宏基因组分析理论教程微生物组入门圣经+宏基因组分析实操课程1背景知识-Shell入门与本地blast实战2...

前情提要

如果您在学习本教程中存在困难，可能因为缺少背景知识，建议先阅读本系统前期文章

宏基因组binning简介

宏基因组研究中，你想不想知道那些序列来自那些菌，想不想拼出末知菌的基因组呢？

其实这些可以有，很多高水平文章中都有，这个过程就叫Binning(我习惯将其翻译为分箱)，是宏基因组分析提升档次的关键步骤。

想了解Bining的背景知识，请阅读《一文读懂宏基因组binning》。想全面了解哪些软件可以Binning，请看《精选30余款宏基因组分析软件》。想知道更全面的Bin软件及评估，可以阅读本月刚发表的Nature Method(http://dx.doi.org/10.1038/nmeth.4458)，或阅读之前写的导读《Nature Method: 史上最权威宏基因组软件评估—人工重组宏基因组基准数据集》，其中有9款Bin软件的简介和比较。

分箱宏基因组

https://2017-cicese-metagenomics.readthedocs.io/en/latest/binning.html

宏基因组拼接以后，接下来常用的分析就是分箱(binning)，即将组装的叠连群(contigs)进行分组或分箱，这些组内可能来自相近的分类学单元。有许多工具可用于Binning，详细介绍和评估见Nature Method: Critical Assessment of Metagenome Interpretation—a benchmark of metagenomics software。本文只介绍两款易用且高引的软件 ——MaxBin (引用105次) 和MetaBAT (引用123次)。为了进行分箱，我们先要使用bwa比对原始序列到拼接结果，估计叠连群的相对丰度。对于分箱的结果，我们要使用VizBin进行检查。

安装分箱工具

MaxBin安装

# 进入工作目录
wd=~/test/metagenome17
cd $wd
# 下载Maxbin
curl  https://downloads.jbei.org/data/microbial_communities/MaxBin/getfile.php?MaxBin-2.2.2.tar.gz > MaxBin-2.2.2.tar.gz
# 解压并安装
tar xzvf MaxBin-2.2.2.tar.gz
cd MaxBin-2.2.2/src
make

cd $wd
git clone https://github.com/COL-IU/FragGeneScan.git
cd FragGeneScan
make clean
make fgs

cd $wd
git clone https://github.com/loneknightpy/idba.git
cd idba
./build.sh
sudo apt-get install bowtie2 hmmer
export PATH=$PATH:$wd/idba/bin
export PATH=$PATH:$wd/FragGeneScan
export PATH=$PATH:$wd/MaxBin-2.2.2

MetaBAT安装

cd $wd
# 此处如下载不成功，自己翻墙下载吧。百度云链接已经被和谐了
curl -L https://bitbucket.org/berkeleylab/metabat/downloads/metabat-static-binary-linux-x64_v0.32.4.tar.gz > metabatv0.32.4.tar.gz
tar xvf metabatv0.32.4.tar.gz

现在开始分箱(Binners)的时间到，注意MaxBin运行时是非常耗时的。本文为了演示，采用牺牲质量而换取时间的方式来让大家演示。

我们只用原文6个数据集中的2，而实际上Bin是数据越多越好的。我们取子集只是为了加速演示。
降低迭代次数，将默认的50次改为5次，将降低结果质量，但显著减少运行时间。详见官方帮助

第一种Bin方法 - MaxBin

Maxbin考虑每个contig的序列覆盖度和四碱基频率，以记录每个bin的标志基因数量.

将count文件传递给MaxBin

mkdir binning
cd binning
mkdir maxbin
cd maxbin
ls $wd/mapping/*coverage.tab > abundance.list # 需要完成第7节：比对

开始bin

run_MaxBin.pl -contig $wd/mapping/subset_assembly.fa -abund_list abundance.list -max_iteration 5 -out mbin

此步会产生一系列文件。看一下文件，会发现产生一系统*.fasta的按数字排列的文件，这些就是预测的基因组bins。先查看less mbin.summary的总体情况

Bin name        Completeness    Genome size     GC content
mbin.001.fasta  15.0%   228392  31.0
mbin.002.fasta  15.9%   404710  33.3
mbin.003.fasta  64.5%   1252476 55.1
mbin.004.fasta  81.3%   1718948 53.5
mbin.005.fasta  82.2%   2737044 37.0
mbin.006.fasta  69.2%   2106585 50.3
mbin.007.fasta  87.9%   1932782 46.1

将所有的bin文件链接起来，并将文件名作为序列名

for file in mbin.*.fasta
do
    num=${file//[!0-9]/}
    sed -e "/^>/ s/$/ ${num}/" mbin.$num.fasta >> maxbin_binned.concat.fasta
done

我们还要生成一个用于可视化的列表

echo label > maxbin_annotation.list
grep ">" maxbin_binned.concat.fasta |cut -f2 -d ' '>> maxbin_annotation.list

第二种方法 - MetaBAT

MetaBAT分箱考虑三点：测序reads覆盖度(read coverage)、覆盖度变异(coverage variance)、和四碱基频率(tetranucleotide frequencies)。

cd $wd/binning
mkdir metabat
cd metabat
ln -fs $wd/mapping/*abundtrim*sorted.bam .
# 统计contig覆盖度
$wd/metabat/jgi_summarize_bam_contig_depths --outputDepth depth_var.txt *bam

运行MetaBAT script

$wd/metabat/metabat -i $wd/mapping/subset_assembly.fa -a depth_var.txt --verysensitive -o metabat -v > log.txt

合并所有的bin结果

for file in metabat.*.fa
  do
    num=${file//[!0-9]/}
   sed -e "/^>/ s/$/ ${num}/" metabat.$num.fa >> metabat_binned.concat.fasta
done

生成bin编号注释文件

echo label > metabat_annotation.list
grep ">" metabat_binned.concat.fasta |cut -f2 -d ' '>> metabat_annotation.list

Bin的可视化

我们现在有MaxBin, MetaBin两种结果，首要先做的是质量评估。最常用的工具是CheckM。但是由于时间有限，今天只介绍VizBin使用。

安装VizBin

cd $wd
sudo apt-get install libatlas3-base libopenblas-base default-jre
curl -L https://github.com/claczny/VizBin/blob/master/VizBin-dist.jar?raw=true > VizBin-dist.jar

java -jar VizBin-dist.jar

想要显示图型界面，需要Xmanager安装成功。也可以在Windows上运行jar程序。

按选择(choose)，菜单中选择$wd/mapping/binning/maxbin_binned.concat.fasta,可以直接点开始(Start)。