腺病毒实验5大问题及解决对策

如何解决细胞感染病毒后高死亡率的问题? 1) 一些细胞株有类似E1区活性 若一定要使用该细胞株,改用较低MOI。 2) 细胞内含有内源性病毒(野生型腺病毒可产生辅助病毒样作用,使非重组腺病毒也能 感染细胞),更换冻存的细胞,初代培养的较适用。 3) 建议先进行目的细胞的转染预实验。

1.    如何解决细胞感染病毒后高死亡率的问题?

1)    一些细胞株有类似E1区活性 若一定要使用该细胞株,改用较低MOI。
2)    细胞内含有内源性病毒(野生型腺病毒可产生辅助病毒样作用,使非重组腺病毒也能 感染细胞),更换冻存的细胞,初代培养的较适用。
3)    建议先进行目的细胞的转染预实验。

2.    如何解决细胞不感染病毒的问题? 1)    尝试不同范围MOI。对于293A之外的细胞株,MOI一般为1~200,对于某些难于感染 的细胞株可能需要更高。
2)    如果使用的是感染目的细胞阳性对照,储存液在应用之前首先应扩增。
3)    优化感染条件:例如以感染293A细胞为阳性对照,以未感染的293A作为阴性对照来监 测细胞培养条件。

 
3.    腺病毒会干扰其他的宿主基因吗?
腺病毒载体是应用较为广泛的病毒载体系统。腺病毒对大多数细胞有几乎100%的感染
效率,包括分裂和不分裂细胞及原代细胞,除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整 合到染色体中,因此不会干扰其它的宿主基因。

 
4.    腺病毒扩增过程中需要注意的问题?

当病毒保存半年以上后,其感染性滴度会降低,再次使用时请重新进行滴度测定。由于腺病毒和 293A 细胞基因组存在重叠序列,有可能进行交叉重组,导致目的基因被 E1 区域置换,从而形成增殖性腺病毒(RCAs)。为了防止 RCAs 的发生,应该在代数较低的 包装细胞中包装及扩增腺病毒,用于感染的腺病毒也应当在较低代数(P4 以内)。
 

5     如何使腺病毒感染细胞时达到最佳效果?
由于细胞表面受体的差异,腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。同时最佳实验结果需要最佳的腺病毒用量,用量少难以达到 100%的转染效率,用量多则可能对细胞有 毒害作用或者其他未知效应。可以通过预实验来判断目的细胞中的腺病毒用量。病毒感染 细胞的最佳时期是细胞处于对数生长时期,因此,在细胞消化接种后 12~24 h 加入病毒。 病毒感染时细胞培养基以覆盖细胞为准,培养基尽量少。一般感染腺病毒后 24 h 能检测到 目的基因的表达,48 h 表达达到最高水平。



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  • 发表于 2018-11-22 13:47
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  • 分类:其他组学

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