腺病毒实验5大问题及解决对策
如何解决细胞感染病毒后高死亡率的问题？
1) 一些细胞株有类似E1区活性 若一定要使用该细胞株，改用较低MOI。
2) 细胞内含有内源性病毒（野生型腺病毒可产生辅助病毒样作用，使非重组腺病毒也能 感染细胞），更换冻存的细胞，初代培养的较适用。
3) 建议先进行目的细胞的转染预实验。
1. 如何解决细胞感染病毒后高死亡率的问题？
1) 一些细胞株有类似E1区活性 若一定要使用该细胞株，改用较低MOI。
2) 细胞内含有内源性病毒（野生型腺病毒可产生辅助病毒样作用，使非重组腺病毒也能 感染细胞），更换冻存的细胞，初代培养的较适用。
3) 建议先进行目的细胞的转染预实验。
2. 如何解决细胞不感染病毒的问题？
1) 尝试不同范围MOI。对于293A之外的细胞株，MOI一般为1~200，对于某些难于感染 的细胞株可能需要更高。
2) 如果使用的是感染目的细胞阳性对照，储存液在应用之前首先应扩增。
3) 优化感染条件:例如以感染293A细胞为阳性对照，以未感染的293A作为阴性对照来监 测细胞培养条件。
3. 腺病毒会干扰其他的宿主基因吗？
腺病毒载体是应用较为广泛的病毒载体系统。腺病毒对大多数细胞有几乎100%的感染
效率，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞，除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整 合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。
4. 腺病毒扩增过程中需要注意的问题？
当病毒保存半年以上后，其感染性滴度会降低，再次使用时请重新进行滴度测定。由于腺病毒和 293A 细胞基因组存在重叠序列，有可能进行交叉重组，导致目的基因被 E1 区域置换，从而形成增殖性腺病毒（RCAs）。为了防止 RCAs 的发生，应该在代数较低的 包装细胞中包装及扩增腺病毒，用于感染的腺病毒也应当在较低代数（P4 以内）。
5 如何使腺病毒感染细胞时达到最佳效果？
由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。同时最佳实验结果需要最佳的腺病毒用量，用量少难以达到 100%的转染效率，用量多则可能对细胞有 毒害作用或者其他未知效应。可以通过预实验来判断目的细胞中的腺病毒用量。病毒感染 细胞的最佳时期是细胞处于对数生长时期，因此，在细胞消化接种后 12~24 h 加入病毒。 病毒感染时细胞培养基以覆盖细胞为准，培养基尽量少。一般感染腺病毒后 24 h 能检测到 目的基因的表达，48 h 表达达到最高水平。
2) 如果使用的是感染目的细胞阳性对照，储存液在应用之前首先应扩增。
3) 优化感染条件:例如以感染293A细胞为阳性对照，以未感染的293A作为阴性对照来监 测细胞培养条件。
3. 腺病毒会干扰其他的宿主基因吗？
腺病毒载体是应用较为广泛的病毒载体系统。腺病毒对大多数细胞有几乎100%的感染
效率，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞，除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整 合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。
4. 腺病毒扩增过程中需要注意的问题？
当病毒保存半年以上后，其感染性滴度会降低，再次使用时请重新进行滴度测定。由于腺病毒和 293A 细胞基因组存在重叠序列，有可能进行交叉重组，导致目的基因被 E1 区域置换，从而形成增殖性腺病毒（RCAs）。为了防止 RCAs 的发生，应该在代数较低的 包装细胞中包装及扩增腺病毒，用于感染的腺病毒也应当在较低代数（P4 以内）。
5 如何使腺病毒感染细胞时达到最佳效果？
由于细胞表面受体的差异，腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。同时最佳实验结果需要最佳的腺病毒用量，用量少难以达到 100%的转染效率，用量多则可能对细胞有 毒害作用或者其他未知效应。可以通过预实验来判断目的细胞中的腺病毒用量。病毒感染 细胞的最佳时期是细胞处于对数生长时期，因此，在细胞消化接种后 12~24 h 加入病毒。 病毒感染时细胞培养基以覆盖细胞为准，培养基尽量少。一般感染腺病毒后 24 h 能检测到 目的基因的表达，48 h 表达达到最高水平。
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- 发表于 2018-11-22 13:47
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- 分类：其他组学
