撰文丨苗苗

责编丨迦溆

日前，作为“诺贝尔奖风向标”的拉斯克奖——拉斯克·科什兰医学特殊成就奖颁给了Joan Argetsinger Steitz教授（致敬Joan Steitz！2018年拉斯克特别成就奖获得者），以表彰她在生物医学领域，尤其是RNA生物学领域中所发挥的领军作用。RNA在生命体内发挥着重要作用。早在1958年，Francis Crick提出的“中心法则”中就指出“DNA makes RNA makes protein”，可见RNA在遗传物质从DNA到蛋白质传递中发挥着“桥梁”的作用。在随后的60年中，尤其是真核生物中广泛存在的基因剪接现象的发现，人们认识到mRNA的作用不仅仅是充当遗传信息从DNA到蛋白质的“信使”，它们还可能是共转录和/或转录后调控的hub。

近年来，随着测序技术的发展及其普及应用，尤其是表观转录组（epitranscriptome）系统的发展，mRNA多种修饰形式及参与调控基因，进而影响细胞生长和发育的机制逐渐被揭秘。2016年Science杂志便做了一期关于RNA信号研究的专题报道，邀请了RNA研究领域中的三位大牛（原MIT，现就职于Yale大学的Wendy V. Gilbert教授，加拿大麦吉尔大学Nahum Sonenberg教授和杜克大学Bruce A. Sullenger教授）分别从mRNA修饰【1】，mRNA翻译调控机制进展【2】及RNA在转化医学中的用途【3】分别进行论述。此后，关于mRNA修饰鉴定方法及其在细胞内已知功能的优秀综述文章大量涌现。然而，关于mRNA前体即pre-mRNA的修饰及其功能的优秀综述文章则鲜有报道。近日，mRNA修饰领域的大咖Wendy V. Gilbert教授和她的同事将她们对pre-mRNA中存在的修饰及其对剪接（splicing）影响的最新见解Pre-mRNA modifications and their role in nuclear processing【4】发表在最新一期Quantitative Biology期刊中。

文章作者首先对目前人类细胞核中存在的mRNA修饰酶及它们催化的核酸分子化学结构的变化进行了汇总（如图1）。随后对目前基于测序技术鉴定RNA修饰的方法进行了简单的归纳概括，即分别是基于特异性抗体富集修饰mRNA的方法和基于化学试剂处理后终止反转录过程中链的延伸来鉴定RNA修饰的方法。

图1人类细胞核内已知的mRNA修饰酶及其所催化的核酸化学结构变化

此外，作者指出为了分析mRNA修饰在mRNA整个生命周期即mRNA代谢中的作用，需要对mRNA修饰酶进行亚细胞定位方面的分析。如已有研究表明，m6A甲基转移酶复合物（m6A methyltransferase complex）与细胞核内储存剪接因子（splicing factor）的颗粒是共定位的，并且m6A甲基转移酶复合物中每个组分的结合位点均可与RRACH motif中的m6A相结合，这一现象暗示了细胞核中的pre-mRNA存在m6A这种修饰形式。对于假尿嘧啶合成酶（pseudouridine synthases, PUS），目前在人类细胞中发现能对mRNA进行假尿嘧啶修饰的仅有3种酶，即PUS1,PUS7和TRUB1。这三种酶至少部分有细胞核定位信号或它们在细胞核内有异构体。如PUS7是与染色质相关的酶，尤其是与激活的Pol II启动子和增强子相结合，这一现象表明PUS7应该作用于新生的pre-mRNA中。又如细胞核内滞留的非编码RNA，如MALAT1在人类细胞中是被假尿嘧啶修饰的，这一结果表明假尿嘧啶合成酶在细胞核内是激活状态的并可以作用与pre-mRNA中。此外，还有m5C和hm5C甲基转移酶也有细胞核定位的信号。但这些酶具体修饰了mRNA生命周期中的哪个阶段还是未知的。为了回答这一问题，可采用如PAR-CLIP的方法来分析RNA修饰酶结合RNA的位点，并结合修饰酶的亚细胞定位情况来综合考虑。人类细胞中mRNA修饰酶在mRNA整个生命周期中的潜在功能如图2。

图2 mRNA修饰在mRNA整个生命周期中的潜在功能示意图

另外，作者还对mRNA和pre-mRNA存在修饰形式的证据进行了汇总（表1）。由于pre-mRNA修饰鉴定技术的局限，除了m6A被确定是pre-mRNA共转录过程中的一种修饰方式外，其它修饰方式是否存在于pre-mRNA共转录过程中还未知。

表1 pre-mRNA中mRNA的修饰

目前已知的剪接过程一般是通过snRNP结合到剪接位点来完成的，但这种结合方式在哺乳动物细胞中一般是比较弱的，因此是可以被调控的。已有研究发现snRNAs的修饰可以影响剪接过程。此外，有证据表明pre-mRNA的修饰也会影响可变剪接。对于pre-mRNA修饰后调控的剪接过程，作者认为可能的分子机制主要有三种，即：

1）在RNA-RNA相互作用层面上，通过改变snRNA与pre-mRNA的相互作用来影响外显子剪接；

2）在RNA-蛋白相互作用层面上，通过增强剪接因子与其在pre-mRNA结合位点之间的相互作用来改变剪接产物；

3）在pre-mRNA二级结构层面上，通过阻断或暴露剪接因子结合位点的二级结构或剪接位点序列对snRNA结合部位的二级结构来实现调控（图3A,3B和3C）。作者以m6A调控剪接机制为例，具体说明了这三种可能存在分子机制（图3D）。

图3 pre-mRNA修饰调控剪接的分子机制

文章的最后，作者认为当前关于pre-mRNA的修饰还知之甚少。除了m6A介导的剪切调控外，在新生的pre-mRNA中是否还存在其它修饰形式以及这些修饰是否或如何调控剪接过程也犹未可知。染色质相关RNA测序技术（chromatin-associated RNA sequencing）以及新转录RNA代谢标签技术（matabolic labeling of newly transcribed RNA）是当前研究pre-mRNA修饰的主要方法。基于当前已发现的RNA修饰能广泛影响RNA与蛋白质的结合来看，未来对pre-mRNA新修饰形式及机制的研究很可能会揭示核内pre-mRNA参与调控的新机理。

参考文献

1. Gilbert, W.V., Bell, T.A., and Schaening, C. (2016). Messenger RNA modifications: Form, distribution, and function. Science 352, 1408-1412.

2. Hinnebusch, A.G., Ivanov, I.P., and Sonenberg, N. (2016). Translational control by 5'-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Science 352, 1413-1416.

3. Sullenger, B.A., and Nair, S. (2016). From the RNA world to the clinic. Science 352, 1417-1420.

4.  Martinez, N.M. and Gilbert, W.V. (2018). Pre-mRNA modifications and their role in nuclear processing. Quantitative Biology 6, 210.

论文作者Wendy V. Gilbert（Jennifer Doudna的博后，现为耶鲁大学副教授）

附：Quantitative Biology（QB）期刊介绍

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