文章分享（三）iCCA的亚型与基因组、表观组、预后以及细胞来源的差异的关系

结合多组学的数据，识别肝内胆管细胞癌的亚型，并对这些亚型拷贝数改变情况、甲基化（如：发生的位置，高甲基化的基因所参与功能）以及各亚型预后等方面进行系统地刻画。

肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA）是指起源于二级胆管及其分支上皮的腺癌，iCCA是第二常见的原发性肝癌，恶性程度较高，预后较差[1]。在此，为大家介绍一篇发在Hepatology 上的关于预后相关低氧免疫分类器的文献【Integrative Analysis Defines Distinct Prognostic Subgroups of Intrahepatic Cholangiocarcinoma 2019.1.3 IF：14.971】

Benjamin Goeppert等人通过整合52个iCCA病人的拷贝数改变数据、甲基化数据以及“MeDeCom”算法[2]得到的细胞组成数据，他们通过“iClusterPlus”识别了iCCA病人四个主要的亚型（如Fig 1所示），即IDH组, L（低改变）组，M（中等改变）组和H（高改变）组，他们发现这些亚型具有广泛的基因组、表观组、预后以及细胞来源的差异。其中，“MeDeCom”是一种R包，该包基于样本DNA甲基化谱刻画其相应细胞组成情况，具体使用参照https://github.com/lutsik/MeDeCom。

因此，根据Benjamin Goeppert等人的研究，根据病人相应的分子谱识别iCCA病人亚型，针对不同亚型的病人给予相应的治疗方案，这位iCCA的治疗指明新的方向。

Fig 1. 分析流程

（1）数据：52个iCCA病人和12个非非肿瘤性胆囊切除术的胆囊管正常样本的甲基化（HumanMethylation450）和拷贝数数据。TCGA数据库中TCGA胆癌（CHOL）数据集（n=51）对应的拷贝数以及表达谱数据。TCGA胆癌（CHOL）、肝细胞肝癌(LIHC)和胰腺癌（PAAD）的甲基化数据。

（2）肿瘤纯度的计算：基于甲基化数据，使用LUMP（leukocytes unmethylation for purity）方法[3]去估计每一个样本的肿瘤纯度，该值的范围是[0,1]。

（3）样本中不同细胞类型组成的刻画：输入甲基化数据，通过R包“MeDeCom”得到样本中不同的潜在甲基化组成（latent methylation components，LMCs）。

（4）iCCA亚型的划分：整合样本的拷贝数数据、甲基化数据以及“MeDeCom”得到的LMCs组成表达谱数据聚类，通过R包“iClusterPlus”对样本进行聚类，得到iCCA的亚型。

（5）生存分析：log-rank检验识别各亚型之间的生存曲线差异，通过构建cox回归模型，评价各亚型是否显著和生存相关。

（1） iCCA病人中突变特征的获取：首先得到在CCA中突变的40个基因列表，接下来去测这40个基因在36个iCCA病人中的外显子数据，进而去识别和iCCA相关的基因突变。在Table 2中，Luo等人识别到了24个突变事件的发生，其中IDH1、IDH2以及TP53基因是频发的错义突变（Recurrent missense mutations）。进一步结合病人的拷贝数数据，得到iCCA中出现的整个染色体臂出现的扩增或缺失基因（Table 3），以及仅跨越染色体臂的一小部分（focal）区域扩增和缺失的基因（Table 4）。

（2） iCCA样本的甲基化特征描述：基于10000个高度变异甲基化基因，对样本进行聚类和计算其相应的肿瘤纯度，通过热图展示疾病和正常样本中甲基化表达模式（如Fig 2A所示），统计低甲基化的基因主要集中发生在基因的哪个区域（如Fig 2B所示）。接下来，通过GO数据库对高甲基化（|β|>0.2 & FDR q<10-300）的基因进行功能富集分析（如Fig 2C），并通过MeDeCom刻画

Fig 2. iCCA样本甲基化特征刻画

（3） iCCA亚型识别：整合拷贝数数据、甲基化数据以及“MeDeCom”得到的LMCs组成表达谱数据聚类，通过R包“iClusterPlus”将样本划分成四类，即IDH组, L（低改变）组，M（中等改变）组和H（高改变）组（Fig 3A），进一步刻画这四个亚型的生存差异（Fig 3B）。

Fig 3. iCCA亚型的识别

（4） iCCA亚型拷贝数特征：拷贝数改变层面，基于Table 4中的候选基因（扩增/缺失），进一步利用TCGA数据库中CHOL（胆癌）疾病的拷贝数以及基因表达谱数据，识别出那些显著受扩增和缺失影响的基因，并进一步分析四个iCCA亚型中拷贝数改变情况（如Fig 4所示）。

Fig 4.iCCA亚型拷贝数特征.

A）四个亚型中基因发生扩增或缺失的情况统计；

B）各亚型中相应染色体中扩增（红色）与缺失（绿色）的情况。

（5） iCCA亚型甲基化特征：将L（低改变）组iCCA亚型病人作为参照，首先，Benjamin Goeppert等人通过韦恩图展示LDH组、L组以及M组亚型病人的特异甲基化位点交叠情况（如Fig 5A），并对LDH组与H组高甲基化启动子位置进行统计（如Fig 5B），接下来，针对H组中特定高甲基化位点的基因进行功能富集分析（如Fig 5C）, 分析LDH组中高甲基化位点的转录因子的分布情况（如Fig 5D）。接下来，为了进一步描绘iCCA亚型病人的细胞组成，将iCCA亚型病人的甲基化数据与TCGA数据库中的胆癌（CHOL）、肝细胞肝癌(LIHC)和胰腺癌（PAAD）的甲基化数据进行整合，并通过MeDeCom算法对这些样本中LMC2-LMC5中的组成情况进行展示（Fig 5E）。

Fig 5.iCCA亚型甲基化特征.

A）LDH组、H组以及M组亚型病人之间特定甲基化位点的韦恩图；

B）LDH组与H组高甲基化启动子的富集分析；C）H组中特定高甲基化位点基因功能富集分析；

D）在LDH组中高甲基化位点的转录因子分布；E）iCCA、胆癌（CHOL）、肝细胞肝癌(LIHC)和胰腺癌（PAAD）病人中LMC2-LMC5的组成。

参考文献：

1. Banales J M, Cardinale V, Carpino G, et al. Expert consensus document: Cholangiocarcinoma: current knowledge and future perspectives consensus statement from the European Network for the Study of Cholangiocarcinoma (ENS-CCA)[J]. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 2016, 13(5): 261-280.

2. Lutsik P, Slawski M, Gasparoni G, et al. MeDeCom: discovery and quantification of latent components of heterogeneous methylomes[J]. Genome Biology, 2017, 18(1).

3. Aran D, Sirota M, Butte A J, et al. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity[J]. Nature Communications, 2015, 6(1): 8971-8971.