标题：Cancer stemness, intratumoral heterogeneity, and immune response across cancers

杂志：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America

IF: 9+   日期：2019.04.17

无论是分析癌症特征性的基因表达谱，还是实验验证发现肿瘤细胞具有长期自我更新和再增殖能力，已经有越来越多的证据表明，肿瘤细胞可以表现出类干细胞的特性。并且研究也发现癌症中控制干性功能的调控程序很活跃，这能够促进癌症的进展并增强癌症的治疗耐药性。此外，研究发现肿瘤T细胞浸润与多种肿瘤的临床结局改善有关。然而，肿瘤的类干性表型（干性）对癌症免疫特性的影响并未被系统地研究。因此，小编向大家介绍一篇研究泛癌中癌症干性与抗原性、瘤内异质性和免疫抑制之间的联系的文章。

1) 数据：作者从泛癌临床资料中提取TCGA数据的临床参数和分子亚型；从Firebrowse (www.firebrowse.org)下载突变数据，作为每个碱基的非同义突变数；从相关文章的补充材料中提取重叠样本的肿瘤纯度、mRNAsi、瘤内异质性、CIBERSORT和新抗原得分。

2) 使用ssGSEA进行干性特征评估。

3) 使用Cox比例风险模型进行生存分析。

4) 使用xCell预测每个患者的免疫细胞浸润

5) 免疫组化分析淋巴细胞浸润

6) 使用limma进行差异表达检验之后，使用ReactomePA进行功能富集分析。

1.干性特征的推导与比较：最近已经有研究表明多种癌症的干性能够用核心的基因表达程序代表。基于这些先前的研究，作者对衡量3200多个芯片样本的间质干细胞、多能干细胞、未分化组织、肿瘤细胞的可塑性及分化水平的基因集使用单样本基因集富集分析（ssGSEA）来推断肿瘤的干性，得到一个干性特征。作者接着将发现的干性特征与其他干性研究结果进行比较发现具有良好的一致性。

2.干性在不同癌症中存在差异，并可预测患者的生存：作者使用干性特征对TCGA样本干性进行评估，发现干性差异很大，54%的变异是由癌症类型引起（图1A）。此外，作者发现在癌症类型中，干性中位数与总生存中位数之间存在很强的负相关关系(图1B)。Cox回归分析同样表明，干性与大多数癌症的总体生存显著的负相关（图1C）。                                                                              图1

3.干性与实体瘤的免疫细胞浸润呈负相关：在这一部分，作者为了评估干性与抗肿瘤免疫之间的关系，作者使用xCell这个基于ssGSEA推断肿瘤微环境的工具预测每个患者的免疫细胞浸润。CD8+T细胞在大多数实体瘤中与预后有良好的关系，但研究发现其在大多数癌症中与干性呈明显的负相关。作者也考虑了其他对抗肿瘤免疫很重要的细胞类型，包括NK细胞和B细胞，并再次观察到与干性负相关。其他类型的细胞，如CD4+T细胞、Tregs和中性粒细胞，与干性之间的关系更加多变，这表明这种关系并不适用于所有癌症中所有浸润的免疫细胞群(图2A)。为了对抗肿瘤免疫产生一个可靠的单一评分(以下称为免疫特征)，作者汇总了xCell对CD8+T细胞、NK细胞和B细胞浸润的预测，认为这些细胞是不同癌症中重要的抗癌效应细胞。分析发现在几乎所有的癌症中，免疫特征都与干性呈负相关（图2B）。接下来，作者评估了免疫特征和干性之间的负相关是否受到肿瘤亚型或分期的影响。在这里，作者重点研究了乳腺癌和子宫内膜癌，它们具有明显的亚型特征，以及黑色素瘤，其原发和转移样本均可在TCGA中获得。在乳腺癌中，不同亚型的干性差异显著(图2C)。在子宫内膜癌中，干性评分最高的是高拷贝数变异和polymerase-epsilon突变瘤，最低的是低拷贝数变异瘤。最后，作者观察到转移性与原发性黑色素瘤相比，干性评分显著升高(图2C)。

                                                                图2

④　干性与免疫组化检测的免疫cold癌症相关：在这一部分作者为了证实干性与淋巴细胞浸润负相关，作者研究了三组匹配基于免疫组化的T细胞浸润得分以及具有计算干性得分的表达数据的样本。研究发现干性与CD3+T细胞浸润显著负相关（图3A）。接下来，作者在35名肺癌患者队列中评估了这种关系，作者计算了T细胞浸润量，作者观察到干性评分与T细胞浸润百分率呈负相关，但未达到统计学意义（图3B）。接着作者研究了一组高级别卵巢癌样本，研究发现干性与CD3+ T细胞总数呈负相关（图3C）。 此外，作者对该队列的样本进行了Getis-Ord Gi* hotspot分析，以量化免疫细胞与肿瘤细胞的结合。发现所有的热点指标均与干性呈明显的负相关(图3D)，表明干性对淋巴细胞与肿瘤细胞的结合有负相关影响

                                                                 图3

5.干性与瘤内异质性相关：作者在这一部分假设干细胞性还可以通过抑制对抗新的肿瘤克隆的免疫选择来促进瘤内的异质性。因此，作者利用两项TCGA研究的数据比较了干性和瘤内异质性。在第一个数据分析中，作者发现在癌症中，中位干性与中位克隆数之间存在显著的正相关（图4A）。此外，在一个控制肿瘤部位和肿瘤纯度的线性模型中，作者发现干性和肿瘤克隆数之间存在正相关，这表明这些关联在癌症之间和癌症内部都是可识别的（图4B）。在第二个关于瘤内异质性的泛癌分析数据中，作者发现了相似的显著相关（图4C）,并且在所有样本中控制肿瘤部位和肿瘤纯度的线性模型中的相关性再次显著（图4D）。

                                                                 图4

6.干细胞相关免疫抑制的潜在机制和结果：这一部分作者评估了干性与几个已知的影响抗肿瘤免疫的遗传和环境因素之间的联系，研究了干性、免疫特征和非同义突变负荷之间的关系。研究发现在所有癌症中，中位突变负荷与中位干性呈正相关（图5A）。同样，在癌症内，作者发现突变负荷和干性普遍正相关（图5B）。Cancer-testis (CT)抗原是一种肿瘤抗原,在多种恶性肿瘤中异常表达，常导致免疫应答。作者利用201个CT基因，生成了ssGSEA CT抗原评分，发现其与癌症干性显著正相关（图5C）。先前有研究证明正常干细胞可以抑制内源性逆转录病毒(ERV)的表达。相反，ERV表达可在癌细胞中被激活，它可能引发抗肿瘤免疫反应。为了更好地理解这一关系，作者研究了干性、免疫特征和ERV表达之间的相互作用。研究发现多数ERV表达与免疫特征的相关性不显著，ERVK家族成员是一个例外，显示出与免疫特征正相关(图5D)。相反，ERV表达与干性呈普遍的负相关(图5D)，这与抑制ERV表达是干细胞表型特征的观点一致。

                                                                 图5

7.肿瘤细胞内的干性介导免疫抑制的机制：为了研究干性与免疫特征之间的关联是否与细胞内在程序有关，作者计算了CCLE中的细胞系的干性得分。接下来，作者生成了I型IFN信号的ssGSEA评分，并在TCGA数据集中普遍观察到与癌症干性负相关(图6A)。作者对一套肺癌scRNA-seq数据集分析也发现在五分之四的患者中干性与IFN α/β信号负相关（图6B）。最后，为了研究其他细胞内在的免疫抑制机制，作者分析了一系列先前报道的免疫抑制基因在人类癌细胞中表达的情况。使用CCLE和TCGA泛癌数据集，评估每个基因的表达与干性的关系(图6 C和D)，结果展示了干性与许多免疫抑制基因之间正相关。

                                                                 图6

这篇文章整合多个数据集对癌症的干性、免疫应答和瘤内异质性进行了综合分析，发现了抗肿瘤免疫与肿瘤干性之间的普遍负相关，以及肿瘤干性与肿瘤内异质性之间显著的正相关。无论是研究所用到的数据还是研究所采用的方法以及思路都值得我们学习借鉴。

1) Gajewski TF (2015) The next hurdle in cancer immunotherapy: Overcoming the non-T-cell-inflamed tumor microenvironment. Semin Oncol 42:663–671.

2) Batlle E, Clevers H (2017) Cancer stem cells revisited. Nat Med 23:1124–1134.

3) Malta TM, et al. (2018) Machine learning identifies stemness features associated with oncogenic dedifferentiation. Cell 173:338–354.e15

4) Bruttel VS, Wischhusen J (2014) Cancer stem cell immunology: Key to understanding tumorigenesis and tumor immune escape? Front Immunol 5:360.

5) Noh KH, et al. (2012) Cancer vaccination drives Nanog-dependent evolution of tumor cells toward an immune-resistant and stem-like phenotype. Cancer Res 72:1717–1727.

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