文献分享（7）circRNA特征预测II / III期结肠癌术后复发

关于识别和验证基于circRNA的特征，该特征可以改善这些患者的术后预后分层的问题。

II / III期结肠癌患者的确切风险分层是术后治疗决策的关键。那么今天小编为大家带来的这篇文章就是关于识别和验证基于circRNA的特征，该特征可以改善这些患者的术后预后分层的问题。该文章于今年发表在EMBO Molecular Medicine杂志上，影响因子10.293。

1）内容

作者选择了667例R0切除的II / III期结肠癌患者。首先作者使用术后收集的20对配对冷冻组织的RNA-seq数据，分析了有和没有复发的患者之间的差异circRNA表达，然后进行定量验证。然后，通过临床信息，作者生成了基于四个circRNA的cirScore，将患者分为训练组中的高风险和低风险组，结果显示在训练组中具有高cirScores的患者比具有低cirScores的患者具有更短的无病生存期（DFS）和总生存期（OS）。接下来作者在内部和外部验证集对分类器的预后性能进行了验证。最后，功能丧失测定表明所选择的circRNA在结肠癌进展汇总可以发挥功能性的作用。总体而言，该4-circRNA的分类器是II / III期结肠癌患者术后疾病复发的可靠预后工具。

2）结果

1.患者的临床病理特征

作者从中山大学癌症中心（487个样本）收集了667名II / III期结肠癌患者的冷冻组织样本进行发现（n = 20），选择（n = 96），培训（n = 249），内部验证（n = 122），以及中山大学附属六院进行外部验证（n = 180）。本研究的流程图清晰地展现了作者的研究思路并在表1中列出了详细临床病理特征以及内部和外部验证数据集。所有患者均进行了手术切除，组织学检查为阴性切除边缘。

图1.研究流程图。

SYUCC =中山大学癌症中心。SAHSY =中山大学附属六院。从SYUCC的样品中以2：1的比例随机选择训练和内部验证组。

表1：本研究涉及II / III期结肠癌患者的临床特征

2.候选circRNA的选择和验证

在这一部分，作者基于RNA-seq数据和生物信息学分析，通过差异表达鉴定了肿瘤和临近正常组织之间的437个circRNA（326个上调和111个下调，之后标记为“TNcircles”）。该分析还鉴定了在复发和非复发肿瘤组织之间的103个差异表达的circRNA（48个上调和55个下调，之后标记为“RNcircles”）。结果表明TNcircles和RNcircles在区分每组时都显示出强大的分类特性并且circRNA在正常和肿瘤组织之间比在复发和非复发肿瘤组织之间显示出更显著的变化（图2A和B）。

接下来，作者研究了circRNA是否可以用作II / III期结肠癌患者的预后生物标志物。首先作者从TNcircles以及RNcircles中选择了100个circRNA用于验证测定。为了降低错误率，作者使用qRT-PCR测定法招募了48个复发样本和48个非复发样本用于进一步验证。最后基于极显著差异选择了22个circRNA。接下来作者在训练集（n=249）中使用qRT-PCR对这22个circRNA进行定量，并且应用LASSO-bagging程序进一步筛选。最后，作者获得了四种强烈预测DFS的circRNA，即hsa_circ_0122319，hsa_circ_0087391，hsa_circ_0079480和hsa_circ_0008039（图2D）。通过AUC分析发现，基于四个circRNA的风险评分（cirScore）的预测性能大多优于单个circRNA（图2E）。

图2.从circRNA实验中进行标记的验证和选择

3.构建和验证基于四个circRNA的预后模型

在这一部分，作者使用从其回归系数加权的四个circRNA的表达水平得到的公式计算每个患者的风险评分：

根据cirScore将患者分为高风险组和低风险组, 生存分析显示，高风险组患者的DFS和OS都低于低风险组。接下来就是验证cirScore的预后性能了，根据与训练集相同的阈值将内部和外部验证集中的患者分类为高低风险两组。结果显示在内部和验证集中，高cirScore的患者都具有较短的DFS和较短的OS。

图3.基于cirScore的II期/ III期结肠癌患者的DFS和OS的Kaplan-Meier曲线

4.选择的circRNA调节细胞转移的功能丧失测定

在这一部分，作者决定评估所选circRNA在结肠癌中的生物学作用。在四种circRNA特征中，三种circRNA（hsa_circ_0122319，hsa_circ_0079480和hsa_circ_0087391）在复发样品和结肠癌细胞中显著过表达。为了评估这些circRNA是否促进结肠癌进展，使用具有高转移潜能的SW620和HCT116细胞通过慢病毒介导的稳定基因沉默进行功能丧失测定并通过qRT-PCR，免疫印迹和RNA-seq分析验证特异性。结果表明，这些circRNA的敲低对宿主基因的mRNA或蛋白质表达没有影响（图4B）。值得注意的是，使用两种独立的shRNA敲低这些circRNA显著抑制了检测细胞中的细胞迁移能力（图4C和D）。

随后，为了进一步确定代表性circRNA在促进体内结肠癌转移中的致癌作用，作者将hsa_circ_0079480敲低和对照细胞注射到小鼠脾中，造模成功后处死小鼠取出脾脏和肝脏。结果显示与注射对照结肠癌细胞的小鼠相比，注射hsa_circ_0079480敲低细胞的小鼠肝脏中转移性结节的数量显著减少（图4E和F）。最后作者通过将结肠癌细胞直接注射到裸鼠的尾静脉中，进一步探讨了hsa_circ_0079480在肺定植中的作用。结果显示注射对照结肠癌细胞的小鼠通过组织学检查证实了重度肺转移负荷，而hsa_circ_0079480的敲低几乎消除了肺转移（图4G和H）。功能丧失测定表明，circRNA可能在结肠癌进展的复杂调节中发挥功能性作用。

图4.调节细胞侵袭的候选circRNA的功能丧失测定。

5.建立列线图和时间依赖的ROC分析

为了开发可以提供3年或5年DFS个体化估计的临床适用工具，作者基于DFS的最终Cox模型建立了列线图（图5A）。列线图的C指数为0.816，校准曲线显示实际DFS概率与训练集中列线图的预测DFS之间非常一致（图5B）。内部和外部验证集中的C指数分别为0.789和0.694。作者提出的列线图的AUC对于DFS达到0.85，对于OS达到0.85（95％CI，0.79-0.91）（图5C）。内部和外部验证集的时间依赖性ROC分析产生了一致的结果（图5D和E）。总之，这些结果强烈表明所提出的列线图用于预测DFS和OS的临床效用。